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一、膜蛋白：生命活動的“守門員”與藥物研發(fā)的“黃金靶點”
蛋白質(zhì)是細胞生命過程的重要執(zhí)行者，而膜蛋白所扮演的角色讓細胞得以成為生命的基本單元。從細菌到哺乳動物細胞，膜蛋白形成了眾多高度保守的蛋白質(zhì)家族，是生物膜功能的主要承擔者，除了完成生物膜兩側(cè)的物質(zhì)、能量和信息的傳輸，還擔負著生物膜的合成、穩(wěn)態(tài)維持等任務(wù)，并且參與細胞之間及膜被細胞器之間的相互作用。正因為如此，膜蛋白與多種人類疾病密切相關(guān)，并且是直接的藥物靶標。
圖1: 典型β桶型膜蛋白E. coliOmp-F的晶體結(jié)構(gòu)
然而，目前膜蛋白的研究仍然存在著較大差距：在人類基因組中，約30%的蛋白質(zhì)基因參與編碼膜蛋白（其余編碼水溶性蛋白質(zhì)）；但膜蛋白僅占蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中沉積結(jié)構(gòu)的約 3.6%（根據(jù)截至 2021 年 11 月的 PDBTM 數(shù)據(jù)庫）。由此也可以看出膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究擁有著廣闊的發(fā)展空間。
二、結(jié)構(gòu)決定功能：膜蛋白的核心類型
膜蛋白分為錨定蛋白和跨膜蛋白（又稱為整合型膜蛋白），后者作為膜蛋白的核心亞型，對于所有生物體維持各種生物學(xué)功能至關(guān)重要，是物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運、跨膜信號傳遞等關(guān)鍵過程的主要執(zhí)行者。例如，離子通道、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體等均為跨膜蛋白，其功能直接決定了細胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換效率和信號響應(yīng)能力，也是后續(xù)深入研究膜蛋白功能與應(yīng)用的核心對象。
圖2：膜蛋白分類
此外，具有天然構(gòu)象的全長膜蛋白因其結(jié)構(gòu)的特殊性和功能的不可替代性，使其成為連接細胞內(nèi)外信號與生命活動的核心樞紐，為揭示 “跨膜區(qū) - 胞內(nèi)區(qū) - 胞外區(qū)” 的相互調(diào)控機制提供關(guān)鍵依據(jù)，補了截斷體研究的局限性。
三、跨越屏障：膜蛋白研究的三大挑戰(zhàn)
由于膜蛋白的高度疏水性使其容易在水環(huán)境中聚集，因此研究膜蛋白通常具有挑戰(zhàn)性，尤其是全長膜蛋白，獲取其完整結(jié)構(gòu)，一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的巨大挑戰(zhàn)。
1.表達困難：當利用傳統(tǒng)的細胞系統(tǒng)（如細菌、昆蟲或哺乳動物細胞）來表達膜蛋白時，其疏水的跨膜區(qū)很容易被識別為“錯誤折疊”，導(dǎo)致蛋白聚集、形成包涵體，甚至對宿主細胞產(chǎn)生毒性，最終無法獲得大量、正確折疊的蛋白。
2.提取與純化困難：為了將膜蛋白“提取”出來進行研究，必須使用去垢劑來模擬其原生膜環(huán)境。這個過程非常苛刻，很容易破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，使其失去活性。提取出來的蛋白也不穩(wěn)定，容易變性或聚集。
3.結(jié)構(gòu)解析困難：經(jīng)典的X射線晶體學(xué)需要獲得高質(zhì)量的三維晶體。但對于構(gòu)象動態(tài)變化的全長膜蛋白來說，使其形成有序的晶體陣列極為困難。
這導(dǎo)致開發(fā)周期長、表達效率不穩(wěn)定、普適性差。對于需要快速驗證的大量候選蛋白，傳統(tǒng)的細胞工廠無法進行與之匹配的高通量并行制造。因此，亟需一種新的蛋白合成方式來擺脫活細胞的局限性。
四、破局之道：無細胞表達系統(tǒng)如何“另辟蹊徑”
無細胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）系統(tǒng)跳出了活細胞的限制，直接在體外利用細胞提取物合成目標蛋白，如同將細胞內(nèi)的生命合成“生產(chǎn)線”搬到了“試管”中。合成體系開放，研究人員可自由調(diào)整離子強度、輔因子濃度；合成過程快速高效，且天然適配高通量操作，可在微孔板中并行合成與測試數(shù)十至上百個候選序列。此外，無細胞體系無生存壓力，可通過外源添加去垢劑或納米盤等成分，為膜蛋白提供類似天然膜環(huán)境的條件，有效維持其結(jié)構(gòu)和功能。
【技術(shù)實踐】：珀羅汀生物依托自主知識產(chǎn)權(quán)的無細胞蛋白表達技術(shù)，膜蛋白表達成功率接近100%。通過在表達的體系中加入去垢劑或納米盤的方式保持膜蛋白的穩(wěn)定性，使得膜蛋白更易表達純化。我們成功表達過的膜蛋白包括細胞色素酶、呼吸鏈酶、ligand receptor等。
無細胞+去垢劑平臺
通過在無細胞體系中直接添加去垢劑，可以為膜蛋白跨膜區(qū)提供疏水環(huán)境，輔助膜蛋白形成正確構(gòu)象，實現(xiàn)全長跨膜蛋白可溶表達。
跨膜蛋白表達
圖3：七次跨膜蛋白
圖4：四次跨膜蛋白
無細胞+納米盤平臺
通過在無細胞體系中加入膜支架蛋白與磷脂，形成類似細胞膜的納米盤結(jié)構(gòu)，可以使合成的膜蛋白直接組裝進納米盤，高疏水性的跨膜區(qū)穩(wěn)定插入脂雙層，獲得高穩(wěn)定性、高活性、接近天然構(gòu)象的全長膜蛋白。
跨膜蛋白表達
跨膜蛋白表達
圖5：七次跨膜蛋白
圖6：四次跨膜蛋白
五、技術(shù)前景與展望
隨著無細胞蛋白表達技術(shù)的成熟，其市場規(guī)模也在穩(wěn)步增長。QYResearch調(diào)研顯示，2023年全球無細胞蛋白表達市場銷售額達到了15億元，預(yù)計2030年將達到23億元。這一增長背后是制藥、生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)焖俚鞍踪|(zhì)開發(fā)工具的迫切需求。
人工智能與無細胞蛋白合成的結(jié)合，正在進一步加速這一領(lǐng)域的發(fā)展。AI已在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、序列生成與功能設(shè)計方面展現(xiàn)出強大威力，而無細胞體系則有潛力成為連接數(shù)字世界與物理實體的高效橋梁，將AI的海量設(shè)計方案快速轉(zhuǎn)化為可測試的真實分子。將人工智能的設(shè)計能力與無細胞體系的快速合成能力相結(jié)合，被視為突破蛋白質(zhì)工程瓶頸的關(guān)鍵。
作為一項技術(shù)，無細胞蛋白表達系統(tǒng)正在重塑膜蛋白研究的格局。從VLP平臺、Nanodisc技術(shù)到我司的無細胞蛋白表達系統(tǒng)，這些創(chuàng)新工具使科學(xué)家能夠在更貼近天然環(huán)境的條件下研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。隨著人工智能與無細胞系統(tǒng)的深度融合，以及新方法的不斷涌現(xiàn)，我們將有望揭開更多膜蛋白的神秘面紗，加速從基礎(chǔ)研究到藥物開發(fā)的轉(zhuǎn)化進程，最終為人類疾病治療帶來新的突破。
參考資料：
1.膜蛋白結(jié)構(gòu)動力學(xué)（第二版）；
2.Zhu, Jingyi, and Peilong Lu. “Computational design of transmembrane proteins.” Current opinion in structural biology vol. 74 (2022): 102381. doi:10.1016/j.sbi.2022.102381；
3.2024-2030年全球及中國無細胞蛋白表達行業(yè)運營動態(tài)及發(fā)展?jié)摿ρ芯繄蟾妗?/span>
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